打孔法抑菌试验

用打孔法做抑菌圈实验是先涂板然后打孔吗

垫底法:就是首先你要准备一个10级以下的装备(别问我为什么,看完..耐心.)和你要强化的那个装备~ 首先把这两个装备都打上2孔~ (表问我暴孔了怎么办,你RP问题)然后一直把10级以下的那件打孔~打打到暴孔为止,然后换你要打孔的那件打上孔成功率很

求抑菌圈实验方法

抑菌圈算是比较容易做的了，贴膜法最常用，具体可以问问你师姐，或者查一下国标。

抗生素微生物检定方法在药典哪部里

抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点

录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。

管碟法的操作步骤：

1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。

6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层

为宜。

8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺

9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。操作要点

第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。

溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。

标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。

一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。

试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。

加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬......余下全文>>

迪尔微生物生化反应怎样判定药敏试验

实验步骤

一、实验材料

普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌(Escherichia coli)的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦康凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）

细菌：待做药敏试验的细菌

仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头

二、实验准备

2.1　药敏片的准备：购买或自制

2.1.1　制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

2.1.2　抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

2.2　药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

三、实验操作方法

3.1　药敏片法

3.1.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

3.1.2　将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

3.1.3　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.2　牛津杯法

3.2.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。）

3.2.2　以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。

3.2.3　将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.3　打孔法：

该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

3.3.1　在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物......余下全文>>

动物药敏试验中药物不敏感的原因有那些？

兽医临床中的药敏试验

目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

一、什么是药敏试验？

抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义

1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。

2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。

3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法

兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。

由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。

1、药敏纸片的制作

纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：

取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。......余下全文>>

抗生素微生物检定方法是在药2010版的哪一部分

抗生素微生物检定管碟法在中国药典中的应用及操作要点录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。管碟法的操作步骤： 1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。 2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。 4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。 5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。 6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。 8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺 9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。操作要点第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大......余下全文>>

生物检定发里面对于剂间是有一定的要求吗

抗生素微生物检定管碟法在中国典中的应用及操作要点