亚硫酸氢盐测序法

一：甲基化的甲基化检测方法

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

二：请问什么是bisulfite sequencing PCR, BSP？

目前, 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。

技术原理：

DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。

1.MSP：DNA经亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶无此改变。DNA的甲基化差异转变为序列差异，设计两对分别针对甲基伐与非甲基化等位基因的引物，结合PCR扩增就可以将甲基化与非甲基化等位基因区分开。这种方法灵敏度高，对DNA的质和量需要少。

2.BSP：甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢钠发生脱氨基后不会转变，用一对特异性引物扩增后测序，再与DNA原始序列比对确定甲基化位点。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。

三：甲基化检测的检测程序

1．甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2．亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。3．高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。

四：dna甲基化盐处理是不是要用到二甲基亚

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。

其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。

五：如何进行DNA甲基化分析

基因甲基化的检测方法主要有以下几种：

甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。

2、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

3、甲基化敏感扩增多态性

(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)

MSAP是利用对DNA甲基化敏感的两种同裂酶Hpa II和Msp I来对基因组DNA进行酶切和连接。由于两种酶能够识别相同的限制性酶切位点，即CCGG位点。当DNA序列中的CCGG位点出现不同程度的甲基化状态时，会分别被这两种酶识别，以有无产物的方式体现出来。

4、焦磷酸测序(Pyrosequencing)

通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

六：如何增强转录因子klf4的功能

Krüppel样因子4(Krüppel-like factor4/KLF4)是一种含锌指修饰结构的蛋白,在某些部位的上皮组织中高表达,如肠道、皮肤等。它在干细胞的形成和抑制胃癌发生、发展中发挥着重要的作用,然而其在原发性肺癌发生、发展中的作用目前尚不明确。 目的:探讨KLF4基因在原发性肺癌发生、发展中的作用。 方法:首先收集肺癌组织标本,从标本水平用免疫印迹、RT-PCR及实时定量PCR检测KLF4基因在肺癌组织及其相匹配的肺正常对照组织的表达;其次,采用甲基化特异性PCR及重亚硫酸氢盐-基因克隆测序法测定肺癌组织KLF4启动子甲基化水平;然后,利用腺病毒载体携带的KLF4基因处理多株肺癌细胞株,用SRB方法观察对肺癌细胞株的活性影响,用流式细胞仪检测细胞周期的变化;建立KLF4基因稳定表达的肺癌细胞株及KLF4基因敲低的肺正常支气管上皮细胞株和K-ras基因转化的正常支气管上皮细胞株,观察KLF4基因对细胞生长、克隆形成的影响;通过动物皮下肿瘤模型进一步观察KLF4基因对肿瘤生长的影响;通过检测KLF4相关基因p21,cyclin D1和端粒酶活性,来进一步揭示KLF4基因影响肺癌发生、发展的机制。 结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中KLF4蛋白水平和RNA水平的表达明显下降;肺癌组织中KLF4表达的下降与其启动子甲基化水平明显增高有关;在肺癌细胞中导入KLF4基因后可以显著抑制细胞生长,及抑制细胞克隆形成。反之,将人类永生化的支气管上皮细胞株中KLF4表达敲低后则促进细胞生长,及显著增加克隆形成;另外,通过动物研究发现,通过转染或通过腺病毒介导方法将KLF4导入肺癌细胞株明显抑制肿瘤生长;KLF4基因导致G_1-S调控点细胞周期阻滞,与激活p21基因,抑制cyclin D1基因有关;另外,KLF4基因在肺癌中发挥的肿瘤抑制机制可能还与抑制端粒酶活性有关。 结论:本研究从肺癌标本、肺癌细胞株和动物模型等诸多方面揭示KLF4基因在肺癌的发生、发展中起着重要的抑制作用。

七：倪虹的人物生涯

1985，7-1990，7 天津医科大学医疗系，获学士学位 1994，7-1999，7 天津医科大学中西医结合外科临床硕士、博士研究生， 　　1999，9-2001，7 南开大学生命科学院分子遗传学博士后　　2004，2-2004，9 澳大利亚悉尼大学访问学者二、工作经历　　1990， 7-2001，12 天津市南开医院普通外科住院医师，主治医师，副主任医师　　2001，12-2005， 2 南开大学生命科学学院任教， 副教授　　2005， 2- 南开大学医学院任教， 副教授三、研究方向　　内容包括：研究领域、科研项目、课题等等主要研究领域：　　1、应激与肿瘤：应激（stress）是个体受到各种应激原刺激时所出现的全身性非特异性适应性反应。近年来的研究表明，应激通过神经内分泌系统启动瀑布式级联效应，修饰肿瘤微环境和激活瘤细胞内增殖和转移相关信号通路，从而影响肿瘤的发生、发展和预后。理解应激在肿瘤演进中的作用和机制，有利于设计合理的临床干预措施和治疗方案。　　2、应激与脓毒症基础研究：脓毒症(sepsis)是指由感染或有高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征(SIRS）。脓毒症病情凶险，病死率高，全世界每年大约1000人中就有3人发生脓毒症和感染性休克。近年来，抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但病死率仍高达30%～70%。本研究方向以揭示应激在脓毒症的发生和发展中病理生理学作用，积极探索针对脓毒症演变过程中应激调节的实验治疗方法，以期为临床治疗提供理论指导。近五年主持科研课题　　1．AFP基因启动子区甲基化状态对基因表达的影响。编号：05yfjmjc08100。 经费来源：天津市科委。起止年月：2006年1月-2008年12月。　　2．自然衍发基质运载Spemann期信息MSCs投递偶联因子防治PMOP骨折的研究. 编号：30571876。经费来源：国家基金委。起止年月：2005年3月-2006年3月　　3．中药组织工程对成骨细胞信号系统作用的研究。编号：03360951。 经费来源：天津市科委。起止年月：2005年1月-2006年12月。　　4．自然衍发基质与构建表达矩阵预言成骨miRNAs的研究。经费来源：国家基金委。编号：30772193。起止年月：2007年3月-2010年3月　　四、学术兼职　　1．中华医学会会员　　2． 中华中西医结合学会会员五、近5年论文　　1. 董天皞，李晓丹，倪虹. AFP基因shRNA表达质粒稳定转染肝癌细胞克隆的构建.南开大学学报(自然科学版),2006,29(5): 368-371　　2. 王娟，倪虹，陈力，陈成彬，宋文芹. 肝癌染色体高频缺失区肿瘤相关基因cSNP在HBV患者和正常人群中的多态分布研究.南开大学学报(自然科学版), 2006, 39(3):1-5　　3. 陈立军，王玮，于利人，倪虹，呼文亮. 亚硫酸氢盐-基因组测序法在检测基因异常甲基化中的应用. 中国肿瘤临床, 2006,33(22):1280-1283　　4. 李晓丹，董天皞，倪虹. IL-10基因单核苷酸多态性与疾病易感性的研究进展.国际遗传学杂志,2006,29(5):368-371　　5. Wang J, Ni H, Chen L, Song WQ. Interleukin-10 promoter polymorphisms in patients with hepatitis B virus infection or hepatocellular carcinoma in Chinese Han ethnic pop......余下全文>>

八：常用的甲基化试剂有哪些

UBL101甲基化检测—引物设计各种检测方法的引物设计2工作日￥300/对引物UBL102甲基化检测—引物合成对设计好的引物进行合成，2OD1周￥60/对  引物长度小于30bp￥2.5/bp 引物长度大于30bpUBL103甲基化检测—BSP克隆测序法设计合成引物、DNA质检、亚硫酸氢盐修饰、扩增、克隆、产物测序、分析报告4-8周询价UBL104甲基化检测—HRM法设计合成引物、DNA质检、亚硫酸氢盐修饰、HRM PCR扩增检测、分析报告4-8周询价UBL105甲基化检测—MSP法设计合成引物、DNA质检、亚硫酸氢盐修饰、扩增、琼脂糖电泳检测、分析报告4-6周询价UBL106甲基化检测—焦磷酸测序法设计合成引物、DNA质检、亚硫酸氢盐修饰、扩增、产物测序、分析报告8-10周询价

九：同一基因在不同植物品系为何表达不同

首先，表达量上存在差异是正常的。这就好比人的身高，虽然都是一个物种，但是不同个体之间是存在着差异的。只要您所扩增的基因不是特别保守的看家基因，那么在不同的品种间就可能存在着差异。

如果你想从表观遗传上分析的话，现在一般的方向是两个：DNA甲基化修饰和组蛋白修饰（甲基化和乙酰化）。我觉得DNA甲基化研究比较容易着手。具体的操作我想你可以这样去考虑：假如你只有两个材料，mutant and wild type.那么，你可以通过亚硫酸氢盐测序法或者焦磷酸测序，直接比较两个材料之间cytosine methylation的状态。可以分析启动子，编码区或者其他地方。具体怎么分析楼主可以根据具体材料和参看相关文章。这个是您在有目的基因的前提下采取的方法。

以上是我的一些想法，可能很不成熟。仅供参考。