一:免疫组化的操作步骤
一 免疫组化(SP法)操作步骤1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复,可在此步后进行2.缓冲液洗 3min/2 次。3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色,将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。4. 缓冲液洗 5min/2 次。5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。(注:孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清,这一步可以省略。)6. 缓冲液洗 5min/2 次。7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)8. 缓冲液洗 5min/2 次。9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子),在室温下孵育 20 分钟。10 .缓冲液洗 5min/2 次。11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ,在室温下孵育 30 分钟。(注:HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)12 .缓冲液洗 5min/2 次。13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混匀后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)14 .自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。 ⑴、石蜡切片脱蜡至水。⑵、 3%H 2 O2 室温孵育 5-10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。⑶、蒸馏水冲洗, PBS 浸泡 5 分钟 x2 (如需抗原修复,可在此步后进行)。⑷、 5-10% 正常山羊血清(PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 分钟,倾去血清,勿洗。滴加 一抗 工作液, 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。⑸、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。⑹、滴加适量 生物素标记二抗 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。⑺、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。⑻、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。⑼、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。⑽、显色剂显色 3-15 分钟(DAB 或 NBT/BCIP)⑾、自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。 冰冻切片 4-8μm ,室温放置 30 分钟后,入 4 ℃丙酮固定 10分钟,PBS洗,5分钟x3,用过氧化氢孵育5-10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。
二:术中的快速冰冻切片与免疫组化有什么区别
oct包埋,切片,冷丙酮固定,按常规步骤染免疫组化(脱水后的),过氧化氢时间看情况延长
三:为什么冰冻切片免疫组化固定液是冷丙酮
冰冻切片可用冷丙酮固定或4%多聚甲醛固定。
固定时间15分钟就可以。
切好固定后的片子可保存在负八十度冰箱。
四:做免疫组化石蜡切片好还是冰冻切片好
石蜡吧,冰冻可以会破坏
五:请教免疫组化的具体步骤!
免疫组化操作步骤
一 免疫组化( LP 法)操作步骤 :
1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复,可在此步后进行
2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
(注:孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清,这一步可以省略。)
6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)
8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 .缓冲液洗 5min/2 次。
11 .滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ,在室温下孵育 30 分钟。
(注: HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)
12 .缓冲液洗 5min/2 次。
13 .向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen ) , 混匀后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)
14 .自来水充分冲洗 , 复染,脱水 , 透明 , 封片。
二.免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 :
( 1 )、石蜡切片脱蜡至水。
( 2 )、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。
( 3 )、蒸馏水冲洗, PBS 浸泡 5 分钟 x2 (如需抗原修复,可在此步后进行)。
( 4 )、 5-10% 正常山羊血清( PBS 稀释)封闭,室温孵育 10 分钟,倾去血清,勿洗。滴加 一抗 工作液, 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。
( 5 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。
( 6 )、滴加适量 生物素标记二抗 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
( 7 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。
( 8 )、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。
( 9 )、 PBS 冲洗, 5 分钟 x3 次。
( 10 )、显色剂显色 3-15 分钟( DAB 或 NBT/BCIP )
( 11 )、自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。
三. 冰冻切片免疫组化染色步骤:
冰冻切片 4-8um ,室温放置 30 分钟后,入 4 ℃丙酮固定 10分钟,PBS洗,5分钟x3,用过氧化氢孵育5-10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化
参考资料:......余下全文>>
六:冰冻切片组织脱水蔗糖溶液怎么配
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋(冰冻切片机内) 4 冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤: 冰冻切片4~8μm,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗,5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗??? 冰冻切片不能用热修复啊!!! 以下是我的步骤: 1 冰冻切片室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,PBS洗,5分钟×2。 2 5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗,5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗,5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗,5分钟×3次。 7 显色剂显色(DAB)。 8 自来水充分冲洗,复染,封片。
七:冰冻切片,he是最常见的制片和染色方法吗
冰冻切片,HE的确是最常见的制片和染色方法
冰冻切片HE苏木素伊红染色步骤
切片固定30秒到1分钟。
水洗。
染苏木素3到5分钟。成熟苏木素制作,加入碘酸钠0.2g碘酸钠每1L苏木素。
分化。
于碱水中返蓝20秒。
伊红染色10到20秒。
脱水,透明,中性树胶封固。