一：急求间接免疫荧光双染实验步骤
FITC：
操作步骤
将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
↓
称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
在10ml小烧杯中先放入抗体
↓
按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
↓
将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算:
2.87×A495
F／P＝————————
A280-0.35×A495
合适的F／P值为2～4。
注意事项：
1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要临用时配制。
3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
二：求助免疫荧光双标染色方法
建议楼主产看文献 wenku.baidu.com/...攉防圭狮氦饯 这个文献可以参考下
三：作免疫荧光双染难吗
这个是重叠的。
pERK一抗用的是兔，二抗是568抗兔抗原；GFAP一抗是小鼠，二抗是488抗小鼠。血清都用了donkey。
照片当中pERK跟GFAP出来的一模一样，所以我怀疑俩片子出来的是不是都是GFAP一种蛋白呢？实在太一样了。不能确定pERK有没有染出来。
我也做过pERK & OX-6 和pERK & NeuN的荧光双染，样像都跟这些照片一样，两种蛋白拍的照片一模一样，所以我怀疑是pERK的问题。
四：免疫荧光双标两种一抗可以一起加吗
一抗种属不同的情况下，免疫荧光双标两种一抗可以一起加：
容易起交叉反应的是二抗，因为二抗会对IGG有反应。而一抗是针对特异蛋白表位的。并不是针对IGG的。
免疫荧光实验方法（连续双标法）
石蜡切片
1)烘片
▷在60℃烘箱放置2-4小时，使蜡流失。
2)脱蜡、脱水
▷二甲苯溶液中脱蜡，2次，每次5min
▷100%乙醇，2次，每次3min
▷95%乙醇，1次，每次3min
▷90%乙醇，1次，每次3min
▷85%乙醇，1次，每次3min
▷H2O，1次，每次3min
3)固定
▷样本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃预冷)
▷用冰的PBS溶液洗2次，每次3min (PBS溶液在-20℃短暂预冷)
4)透化
▷用含0.25%Triton X-100的PBS孵育石蜡切片10min (200mlPBS+500ul Triton X-100)
▷用PBS溶液洗3次，每次5min
5)第一荧光标记
▷用PBST配置1%的BSA封闭液，将切片在封闭液中孵育1h
▷4℃冰箱，一抗过夜
▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行）
6)第二荧光标记
▷4℃冰箱，一抗过夜
▷用枪吸走一抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min
▷二抗室温1h
▷用枪吸走二抗液体，PBS溶液洗3次，每次5min（避光条件下进行） 7)DAPI对比染色
▷2µg/ml的DAPI，15min
▷用PBS冲洗3次
8)封片
▷用移液枪吸中性树脂一小滴，盖上盖玻片，用指甲油涂抹边缘，待风干后显微镜照相
五：免疫荧光双染，为什么图像形态一模一样
主要是你检测的目的是不是一致的,如果一个是凋亡的一个是存活的话,那就肯定有问题了.如果你检测的都是存活状态下的,那自然一样了.从图片看,的确染色一样.
你可以先关掉红色的激光器（559），单独扫描绿色的，反之扫描红色的，看看片子是否和两个激光器同时扫描时想同，如不同则说明你染的片子窜色了，这是你双标染色时抗体的浓度，浸染时间等等原因造成的，因为我不知道你的Protocol，所以不好说。解决的办法你可以用Sequential扫描试试，如不成只能重新做了。做的时候可以先做个预实验，把抗体的浓度降低，用两次单标的方法染色，分别看，再做对照，问题就能解决了。
还有你用共聚焦显微镜扫描的时候或是降低激光输出（Laser）值调低或是调节HV和Offset的值，把背景去掉，因为你的强度太高了。
六：免疫组化双染的问题
多重免疫酶标记染色
以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。在光镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。
常用标记酶与底物的配伍
单酶双底物--HRP--DAB (棕色):4CN(蓝色)
AEC(红色):4CN(蓝色)
AP-萘酚AS-MX-坚固红(fast red 红色)-坚固蓝(fast blue 蓝色)
双酶双底物--HRP (DAB ) :AP(萘酚AS.MX-坚固蓝)
HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-坚固红)
（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）
七：细胞膜和细胞浆表达，如果实现免疫荧光染色，能双染吗
细胞膜和细胞浆表达，如果实现免疫荧光染色，能不能双染要看具体的目的
如果是 co-localization 证明两种蛋白在同一个细胞中表达是可以双染的
如果想进一步呈现两种蛋白在一个细胞中不同的亚细胞分布定位，这个取决于两个因素，第一是蛋白本身的表达是否有明显的亚细胞定位特征。第二需要高分辨率的显微镜，能有助于区别两种蛋白在一个细胞中不同的亚细胞定位
所以细胞膜和细胞浆表达，如果实现免疫荧光染色，能不能双染要看具体的目的
八：帮忙看看我的免疫荧光出了什么问题
你好，细胞生物学产品专家齐氏生物很高兴为您解答，以下是荧光免疫染色常见的5个问题：
1、问:用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同?
参考见解:只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
2、问:近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项?
参考见解:我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是:
(1)选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
(2)我的做法是两种一抗（CHI抗体）同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
(3)我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
(4)封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
(5)其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
3、问:本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠:
(1)抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行?
(2)封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片?
(3)免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用?
参考见解:
(1)你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光;
(2)封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明;
(3)关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶;2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
4、问:做间接法免疫荧光染色，如何设置对照?
参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。
(1)空白对照:如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
5、问:我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好:有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光显微镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢?
参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。
希望能帮您答疑解惑！
九：免疫荧光中的染胞质的和染胞浆的图合并可以用photoshop吗
也可以，不过有专门的图片处理软件昂，不但是
photoshop还有其他软件的，专门用于分析这个的
十：双重免疫荧光为什么要复染细胞核
因题干条件不完整，缺少文字，不能正常作答。
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