一：酶联免疫吸附测定实验（ELISA）的操作流程，谢谢大家
Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT为例）：
检测原理:
本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。
试剂盒组成：
1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）
2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）
5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）
7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板胶纸（6/3 张）
12．产品说明书（1 份）
标本收集:
1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。
3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。
注意事项:
1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。
2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。
4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。
5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。
9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。
检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。
3......余下全文>>
二：什么是酶联免疫吸附试验？
酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 自从Engvall和Perlman（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。 目前ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 (一) 基本原理 ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 (二) 用于标记的酶 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。 1.辣根过氧化物酶（HRP） 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18％），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50％饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。 酶的纯度以RZ表示：RZ＝OD403/OD275 纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75％，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解......余下全文>>
三：酶联免疫吸附实验的实验报告怎么写
酶免疫技术的基本原理是用酶标记的抗体（或抗原）与标本中的相应抗原（或抗体）特异性结合，用酶催化底物反应的生物放大作用显示免疫复合物的存在，提高检测检测抗原抗体复合物的敏感性，基于上述基本原理，临床的应用发展主要有酶免疫组化技术...
四：做酶联免疫吸附试验应注意些什么
1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C～25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。
2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。
3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。
4、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。
5、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。
6、试剂的影响因数：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。
五：酶联免疫吸附实验测艾滋病毒要多长时间
HIV百科内容来自于:艾滋病，既获得性免疫缺陷综合症（ AIDS ），是由人类免疫缺陷病毒（ HIV ）引起的一种免疫缺陷性疾病。到 2002 年 6 月底全球已有 6000 万人感染了 HIV ，其中 2000 万人已被艾滋病夺去生命，艾滋病正已每天 1.4 万人受感染的速度扩大流行，目前该病尚无法治愈，也无有效疫苗。截止到 2003 底我国 HIV 感染者已近 84 万，进入了快速增长期，据有关专家估计，如不采取积极有效的控制措施，到 2010 年我国 HIV 感染者将达 1000 万，形势十分严峻。 HIV 感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。通过检测 HIV 的特异性抗体、抗原、核酸或病毒分离培养可确立 HIV 感染， WHO 和我国卫生部推荐使用的 HIV 感染诊断方法是血清学抗体检测。。 1. 一、 HIV 检测的特殊性HIV 检测不同于其他病原微生物检测，要求十分严格，任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者产生十分重要的影响。因此， HIV 检测必须严格按照国家制定的《艾滋病检测工作管理办法》和《艾滋病检测技术规范》（以下简称《规范》）进行，检测的实验室须经当地卫生行政部门审批合格，从事艾滋病检测工作的技术人员须接受专门的技术培训，并获合格证书，诊断试剂应选择高敏感和高特异的，筛查呈阳性反应的需用特异性更强的方法（如：免疫印迹试验）进行确认，整个实验过程应有严格的质量保证体系。 2. 二、 HIV 抗体检测目前国外用于 HIV 抗体筛查的方法很多，根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和层析法，可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。在实际工作中常用的有酶联免疫吸附试验（ ELISA ）、明胶凝集试验和各种快速诊断试剂。自 1985 年第一代 ELISA 试剂问世以来，随着医学技术的飞速发展，包被抗原已从一代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组和多肽抗原包被和标记、有着良好敏感性和特异性的三代双抗原夹心试剂，检测亚型包括 HIV-1 、 HIV-2 和 HIV-1 型的 O 亚型，窗口期由 10 周缩短至 3-4 周。为避免窗口期传染，荷兰、法国等国已研制出第四代以重组的多肽抗原和抗 P24 抗体包被的双抗原夹心法试剂盒，可同时检测抗原抗体，使窗口期缩短了 2-3 周，但其临床价值有待评估。按《规范》要求，我国采供血机构进行血液筛查和各医疗卫生机构常规筛查检测宜采用 ELISA 法，自采自供血的单位必须进行 HIV 抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区或大医院急诊手术前可由经过培训的技术人员在规定的场所用快速试剂进行血液筛选。对用 ELISA 试剂或快速诊断试剂进行的筛查实验如呈阴性反应，即报告 HIV 抗体阴性；对呈阳性反应的标本，筛查实验室应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告 HIV 抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。筛查试剂必须是 HIV-1/2 混合型、经国家药品监督管理局（ SDA ）注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。 HIV 抗体筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能，必须做确认试验。国际上有 3 种确认试验方法，包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验，目前以免疫印迹试验最为常用。确认试剂必须经 SDA 注册批准。免疫印迹试剂有 HIV-1/2 混合型和单一型，按《规范》要求，一般先用 HIV-1/......余下全文>>
六：酶联免疫吸附分析法主要有哪三种
双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
双抗体夹心法
一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
双位点一步法
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶......余下全文>>
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