酶活性的测定方法

一：测定酶活性的条件是什么

我国检验学会文件中对最适条件是这样提出：①选合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度。②指示酶和辅助酶的种类和浓度。③反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓厂。④其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。并提出：在某些情况下，为了获得更好的测定重复性或更大的临床价值，可考虑对上述“最适条件”作适度的修改。

参考这里：tieba.baidu.com/f?kz=85037254

二：血清酶活性测定的方法主要有哪些

1.反应速度 　　大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。当底物浓度较高时，在反应的初期，其浓度变化甚微，产物生成量也很少，此时反应速度可看作是恒定的。酶反应动力学中所指速度就是反应的初速度。 　　2.底物浓度 　　米氏方程ν=νmax【S】/Km+【S】是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式，其中Km称米氏常数。 　　Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。不同的酶，Km值不同。同一个酶有几种底物时，则对每一种底物各有一特定的Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。 　　综上所述，根据酶的特性及定量原理，测定酶活力时，必须注意以下几点： 　　（1）酶促反应过程中，只有最初一段时间内反应速度与酶浓度成正比，随着反应时间的延长，反应速度即逐渐降低。 　　（2）要规定一定的反应条件，如时间、温度、pH等，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定，如温度不得超过规定温度的士1℃，pH应恒定。 　　（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。 　　（4）标本要新鲜，由于绝大多数酶可因久置而活力降低，标本如无法及时测定，应保存于冰箱中。用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。有些酶在血细胞、血小板中的浓度比血清高，为此在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。 　　（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱、蛋白沉淀剂等。

三：酶活性测定的原理是什么

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买二抗的时候发现，有些抗IgG的抗体还有分特异抗重链或者轻链，但是一般做二抗的好像没有分。请问各位大侠，这些有特异性的抗体能做二抗么？其结果跟一般的二抗有区别么？

抗IgG是有三种二抗抗体：Whole IgG，抗轻链的针对F(ab’)2/Fab片段的IgG，抗重链的针对Fc片段的IgG。

其中Whole IgG是完整的抗体分子，有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分，适 ...

四：还原酶活性测定方法

实验方法

预先将丙酮酸钠溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。

取2支石英比色杯，在2支比色杯中加入0.1mol/L pH7.5磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一支比色杯用于测定LDH活力依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml、NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后，测定340nm光吸收比值。

取出比色杯，加入稀释后的酶溶液10μl，立即即时，摇匀后，每隔0.5分钟测A340，连续测定3分钟。

以A对时间作图，取反应最初线性部分，计算没分钟A340减少值。

注意事项

实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，则应储存在-20℃冰箱。

酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1~0.2之间，以减少实验误差。

NADH溶液应在临用前配制。

五：请问DNA聚合酶活性的测定方法是什么?

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买二抗的时候发现，有些抗IgG的抗体还有分特异抗重链或者轻链，但是一般做二抗的好像没有分。请问各位大侠，这些有特异性的抗体能做二抗么？其结果跟一般的二抗有区别么？

抗IgG是有三种二抗抗体：Whole IgG，抗轻链的针对F(ab’)2/Fab片段的IgG，抗重链的针对Fc片段的IgG。

其中Whole IgG是完整的抗体分子，有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分，适 ...

六：酶活测定方法有哪些原则？最好是详细的答案

一、原则

pH值和温度

体外测定酶活力时选择的测定条件应尽可能接近酶在动物体内的消化环境。

干扰成分

侧定酶活力时应尽可能的去除干扰成分。

底物

在选择底物时一定要用纯度较高的底物，底物的反应浓度也不应太高。

酶样的稀释度

稀释度要适中，过高，酶活力与产物生成量的关系就会超出线性范围。

其他因素

酶促反应时间、反应体系的离子强度等因素也可以影 响酶活力的测定结果。因此,在酶活力体外测定时需要对这些 因素进行深人研究。

二、酶活测定方法

还原法

酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。

色原底物法

通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。

粘度法

该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法

酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法

常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法

将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

七：酶活性中心的测定方法

测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等。

1.化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显著下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。

2.动力学分析法：酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用。另外，改变反应温度求出Vmax和Km与pH关系，从而求出有关基因解离的DH，DH的求得有助于补充pK值对活性中心的判断。在有机溶剂存在条件下，测定酶pK值与介电常数的关系，也有助于对活性部位的判断。

3.X－射线衍射分析法：化学修饰法和动力学分析只能推断酶活性部位氨基酸残基的数目，活性中心空间结构的信息，则需用X－射线衍射法。采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。

4.蛋白质工程：蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进的方法。蛋白质工程实质是按照人们的设想，通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。利用基因定点突变技术将酶相应的互补DNA（cDNA）基因定点突变，突变的cDNA表达出被一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为酶活性所必需。此方法可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基和不引起底物和活性中心结合的立体障碍，以及可人工地造成一个或几个氨基酸的缺失或插入，了解肽链的缩短或延长对酶活性的影响和定点改变酶蛋白的糖基化位点或磷酸化位点，从而了解糖基化或磷酸化对酶结构和功能的影响。