超氧化物歧化酶的测定

一：超氧化物歧化酶的测定

超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2 ，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。1.直接法 原理是根据O2 或产生O2 的物质本身的性质测定O2 的歧化量，从而确定SOD的活性。经典的直接法包括：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法（EPR）、核磁共振法。由于所需的仪器设备价格昂贵，一般较少应用。2.一般化学法 这些方法的共同特点是要有一个O2 的产生体系和一个被O2 还原或氧化的可检测体系。在SOD存在下，一部分O2 被SOD歧化，因而O2 还原或氧化检测体系的反应受到抑制。根据反应受抑制程度，测定SOD的活性。一般化学法有邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法、没食子酸法、6-羟多巴胺法、亚硝酸盐形成法和碱性二甲亚砜法。常用的有：⑴ 邻苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法，在碱性条件下，邻苯三酚自氧化成红桔酚，用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、420nm或650nm（经典为420nm），同时产生O2 ，SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化，样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强，所需样本量少（仅50μl），操作快速简单，重复性好，灵敏度高，试剂简单等优点。⑵ 细胞色素C还原法（McCord法）：原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时，由于一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少，即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线，由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法，但本法灵敏度较低。3.化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生O2。后者可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。SOD能清除O2 从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定，不仅灵敏度高，简便易行，而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。4.免疫学方法上述方法测定的是SOD活性，免疫学方法则可测定样品中SOD的质量，因此特异性较好，是较理想的测定SOD方法，免疫法有放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。但其缺陷是只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，则须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。5.电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色（呈现棕色区带）也可采取SOD活性负染色（呈现无色透明区带）。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。6.平行放在距20 W荧光灯管3 cm处的光照台上，光照8 min后，立即在200A分光光度计的460 nm波长下比色。用测得的结果计算样品中的SOD含量.....

二：检测超氧化物歧化酶体外定量测定与测量活性有什么区别

检测超氧化物歧化酶体外定量测定与测量活性有什么区别

①DPPH 1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名 1,1-二苯基-2-苦肼基，俗称自由基。DPPH有两个主要的应用，都用于实验室研究中：一是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，典型的用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价 ；还可以作为电子顺磁共振信号位置和强度的标准物质。

②超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。

③CAT（过氧化氢酶）存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用就是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不致于与O2在铁螯合物作用下反应生成非常有害的-OH

几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。

④丙二醛（MDA）生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。脂质氧化终产物丙二醛（MDA）在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

三：超氧化物歧化酶(SOD)活性测定试剂盒价格

南京建成生物工程研究所生产的SOD试剂盒，测总SOD，序号A001-1，规格100管/96样，价格370元；测分型SOD（Cu-Zn、Mn、总），序号A001-2，规格100管/96样，价格410元。详细登录www.njjcbio.com。

四：超氧化物歧化酶的临床意义

在国外，SOD常用于对缺血、出血性心、脑等重要脏器病伤（或手术治疗后）引发的继发性（自由基）过氧化损伤及其自由基清除药物治疗效果的监测，以指导临床制定相应的自由基清除干预对策及最佳治疗时间窗的确立，它对自由基继发损伤病情的诊断、自由基清除治疗疗效跟踪和预后判断与评估等具有重要参考价值。　　比较一致的意见是：SOD测定虽然是一种非特异的辅助诊断指标，但对机体自由基代谢紊乱、自由基清除干预对策、以及对于同一病患者病程转归（自由基损伤的加剧或降低、自由基清除剂药物或手术治疗效果）的判断，实时动态监测具有重要参考价值。　　1、SOD水平降低　　（1）生理性降低：　　①机体抗氧化营养素摄入不足 如VitE、VitA、VitC、β-胡萝卜素、硒、铜、锌、锰等缺乏，硒是GSHPx 的组成部分，铜锌是Cu/Zn-SOD的成分，锰是Mn-SOD的成分。　　②一般老年人清除酶活力降低，老年人新陈代谢功能下降，酶诱导生成减少，不能维持自由基的低浓度动态平衡。　　（2）病理性降低：　　①脑部神经疾病脑血管病：急性脑梗死、脑出血、蛛网膜下腔出血、HIE(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy, 缺氧缺血性脑病)、外伤：颅脑损伤　　②缺血性心脏病心肌缺血（冠状动脉粥样硬化性心脏病）、急性心肌梗塞　　③医学手术救治治疗后继发损伤　　缺血-再灌注损伤（IRI）　　全身循环障碍待恢复血液供应后造成再灌注损伤：休克微循环痉挛解除、心脏骤停后心脑肺复苏、体外循环的建立与撤除（如：心脏外科体外循环术后重新恢复血流供应后可能造成心肌缺血-再灌注损伤等）　　某一组织器官缺血后血流恢复或某一血管再通后造成再灌注损伤：如动脉搭桥术、经皮腔内冠脉血管成形术（PTCA）、溶栓疗法、器官移植、断肢再植、冠状动脉痉挛解除等　　高压氧（HBO）治疗后过度氧化损伤　　放射治疗后过氧化损伤：放射性脑病　　2、SOD水平增高　　（1）生理性增高：　　长时间外源性增加过多的SOD，机体将不能维持一定量的自由基水平，免疫细胞使用自由基作为一个方法执行其免疫功能，过低的自由基会引起生理生化过程失常，破坏正常的生理功能，如：机体解毒、吞噬功能下降、凝血过程受阻及胶原蛋白、前列腺素、环核苷酸合成受损等，并引起严重的毒副作用。　　（2）病理性增高：　　国内外研究表明，在急性病患发生初期，当机体自由基产生大幅过多激增时，机体会很快引起氧化应激，并影响到蛋白质表达等调节、应答机制。在自由基的诱导及机体代偿应激下，细胞或机体会诱导性地增强抗氧化能力，一般会出现一过性SOD水平增高现象。但随着高浓度自由基对SOD的大量消耗，以及机体的失代偿，SOD的生物合成能力会很快回落到低水平，并与较高浓度的自由基保持新的动态平衡。3、临床监测2012年，为了完善检验项目，更好地为临床服务，禅城区中心医院检验科生化室日前开展了超氧化物歧化酶（SOD）的检测 。

五：检测超氧化物歧化酶是空腹吗?

标本采集』

采空腹血2ml，不抗凝，勿溶血。

『正常值范围』

红细胞：5375—797Hb。血液：242—610U/L。

六：SOD的测定方法有哪些

1、测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

2、在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

（1）改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

（2）化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

（3）Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。

（4）亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。