重组蛋白纯化

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首先，蛋白表达与纯化包括很多种类型，比如原核蛋白表达，哺乳动物蛋白表达，酵母蛋白表达以及昆虫蛋白表达等等，而现在生物实验中常说的蛋白表达纯化通常是指利用大肠杆菌表达系统的原核蛋白表达，这种表达方式比较简单，普遍都可以做。但是如果是指很多种蛋白表达系统的话，可以做的单位就比较少了。

另外，蛋白的表达成功与否还需要取决于蛋白的性质，所以前期一定要问清楚！

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四：蛋白质表达纯化文章 都需要哪些

蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。

实验方法原理携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料大肠杆菌BL21

试剂、试剂盒LB液体培养基氨苄青霉素Washing BufferElution BufferIPTG蒸馏水胰蛋白胨酵母粉氯化钠

仪器、耗材摇床离心机层析柱离心管移液枪枪头盒烧杯玻璃棒

抗体CD2抗体山羊Lambda Light Chain多克隆抗体山羊Complement C4多克隆抗体

实验步骤一、试剂准备

1. LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因

1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

三、构建重组表达载体

1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种

1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

2. 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3. 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养。

2. 按1∶50或1：100的比例稀释菌，一般转接1 mL培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。

3. 对照组不加诱......余下全文>>

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组氨酸标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。

2．1 IMAC(Immobilized Metal-io

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